FRET

La technique de FRET Par Moundirdekohlanta

1) Introduction : Définition et Histoire du FRET

Certaines molécules absorbent de l’énergie lumineuse par absorption de photons et deviennent excitées. Pour se désexciter, elles vont émettre d’autres photons rapidement. C’est le phénomène de fluorescence. La longueur d’onde lumineuse d’excitation de la molécule est plus basse que celle d’émission.

Le transfert d’énergie entre molécules fluorescentes (FRET) est une technique qui permet de visualiser des interactions entre 2 molécules fluorescentes[1]. Une molécule fluorescente excitée, le donneur transfère son énergie sous forme non radiative vers un accepteur. Ce dernier est une autre molécule fluorescente non excitée. Donneur et accepteur doivent être situés assez proche. La fluorescence du donneur diminue alors que celle de l’accepteur augmente. Cette technique permet de visualiser des interactions entre 2 molécules distante de 1à 7 nm. Ces interactions sont du faite de la limite derésolution du microscope optique de 200nmnon visualisables(due a la longueur d’onde de la lumière limite de résolution de λ/2). Elle permet aussi de faire études dynamique.

La première observation de transfert d’énergie entre 2 fluorophores a eu lieu en 1922 par Carlo et Franck[2]dans un mélange de thallium et de vapeur de mercure. En excitant à une longueur d’onde de 253 nm uniquement les atomes de mercure, le thallium émet de la fluorescence. Ils nommèrent cela fluorescence par sensibilisation. C’était évidement due a un transfert de l’énergie d’excitation du mercure aux atomes de thallium. Après cela de nombreux autres expériences similaires de «  fluorescence par sensibilisation » avec d’autres composés ont été observées.

Il faudra attendre jusqu’en 1946 pour que Théodore Förster un physicien et chimiste théorise et modélise complètement ce phénomène. Il travailla sur la photochimie et la fluorescence et fit de nombreuses découvertes. Ces découvertes ont permit la mise au point des techniques de microscopie par fluorescence moderne. On lui doit les formules modèles de calcul de l’efficacité du transfert. Les applications de la technique de FRET ont débutées dans les années 1950. Dans un premier temps, elles étaient réservées au domaine de la physique. C’est dans les années 70 que les applications de la technique aux domaines de la biologie, de la médecine, de la chimie et de l’ingénierie ce sont développées.

2)Conditions du FRET

On parle de FRET quand une molécule fluorescente excité « donneuse », transfert de l’énergie vers une autre molécule fluorescente « accepteur». Le transfert entre les 2 ne se fait pas par radiation lumineuse, mais par une interaction entre les charges des 2 molécules. L’énergie transmit à l’accepteur est plus faible que l’énergie d’excitation du donneur voir le diagramme de Jablonsky (Figure 1). La longueur d’onde de fluorescence est proportionnelle à l’inverse de l’énergie. Donc la longueur d’onde de fluorescence du donneur est plus basse que celle de l’accepteur.

 

Figure 1: Diagramme de Jablonsky. La molécule D (le donneur) passe a l’état excité D*. En fournissant son énergie d’excitation à A (accepteur), il permet son excitation sous forme A*.

Pour pouvoir réaliser du FRET entre 2 molécules fluorescentes, il faut respecter 3 règles :

1) Il faut que les 2 molécules fluorescentes soient des dipôles électrostatiques (elles doivent avoir une répartition des charges plus et moins différentes). L’émission du dipôle donneur ne doit pas être orthogonal au moment du dipôle de l’accepteur.

2) Il faut que le spectre d’émission du donneur chevauche (au moins partiellement) le spectre d’excitation du receveur (Figure 2). Ce chevauchement de spectre est décrit par la formule de l’intégrale de recouvrement J(λ). Plus J est grand, plus le spectre d’émission du donneur chevauche celui d’excitation du receveur. Et plus le couple de fluorophore est capable de transférer de l’énergie par FRET.

Figure 2 : Intensité d’excitation et d’émission du donneur et de l’accepteur en fonction de la longueur d’onde. Le spectre d’émission du donneur et d’excitation de l’accepteur se chevauchent. La partie rose correspond a l’intégrale de recouvrement des 2.

Les spectres de nombreux fluorophores se recoupent, donc ils font choir le bon couple de donneur et accepteur pour avoir une efficacité et spécificité de transfert optimale.

3) Il faut pour finir que les molécules fluorescentes soit proche entre elles. La distance entre les 2 doit être inférieur à 1,5 fois la distance de Förster. Ce qui correspond environ à 1±10 nm. Il est possible de calculer à partir du recouvrement des spectres, la distance de Förster. Celleci correspond à la distance entre les 2 fluorophores ou l’efficacité de transfert est égal à 50 %

3)Efficacité de transfert

Si toutes les conditions précédentes sont respectées, il peut y avoir transfert de l’énergie du donneur excité vers l’accepteur. L’intensité de fluorescence du donneur diminuera avec le transfert d’énergie. A l’inverse l’intensité de fluorescence de l’accepteur augmentera. La mesure de ces variations de fluorescences permet de déterminer l’efficacité du transfert d’énergie. C’est le rendement quantique du transfert d’énergie. Il se calcule grâce au rapport entre le nombre de molécules désexcitées par le transfert d’énergie, divisé par le nombre total de molécule initialement excitées.

Figure 3 : Efficacité du transfert en fonction de la distance du donneur et de l’accepteur. Pour une efficacité de 50 %, la distance entre les 2 est celle de Förster. La courbe est une sigmoïde. Dans cette exemple pour des valeurs entre 20 et 60 A, l’efficacité de transfert varient de 95 %.

Sur cette formule, R est la distance qui sépare les 2 molécules fluorescentes. Ro est la distance de Förster (voir plus haut). L’efficacité de transfert est inversement proportionnelle à la distance entre le donneur et l’accepteur à la puissance 6. L’efficacité de transfert est grande que si la distance entre les 2 est très faible (1 à 10 nm voir Figure 3). La distance entre l’accepteur et le donneur peut ainsi être évalué.

4) Visualisation et mesure du FRET

Il y a plusieurs moyens de visualiser et quantifier le transfert d’énergie. Dans la plupart les cas, le FRET est visualisé a l’aide de microscope a fluorescence confocal (monophoton, 2 photons spinning disque etc….). Il faudra choisir un filtre laissant passer les longueurs d’ondes d’excitation et d’émission du donneur. Un filtre laissant passer les longueurs d’ondes d’émission et d’excitation de l’accepteur. Et un troisième filtre FRET laissant passer que les longueurs d’ondes correspondant à l’excitation du donneur et l’émission de l’accepteur. Ce troisième filtre est crucial, il permet de visualiser spécifiquement le FRET. Le problème est que souvent l’émission du donneur et l’excitation de l’accepteur se superposent. Et vice et versa.

Soit en mesurant directement le transfert d’énergie entre le donneur et l’accepteur. Pour cela on peut mesurer la diminution de fluorescence du donneur ou l’augmentation de fluorescence de l’accepteur. Dans ce cas, les images obtenues sont le ratio entre la fluorescence de l’accepteur sur celle du donneur. S’il y a FRET le ratio augmentera. Souvent sur les images de FRET les valeurs de ratio élevé sont en couleur « chaude » (rouge voir blanc pour le transfert d’énergie maximum). Et les valeurs de ratio faible sont en couleur « froide » (bleu).

La diminution de fluorescence du donneur lors du FRET, peut être quantifié par photobleaching de l’accepteur. Dans ce cas, il n’y a plus de FRET. Et la fluorescence du donneur est supérieur sans le transfert d’énergie vers le donneur. La différence de fluorescence avec le FRET et en photoblanchissant l’accepteur nous permet d’évaluer l’efficacité du transfert.

Ou indirectement en mesurant le déclin dans le temps de la fluorescence du donneur ou de l’accepteur (on parle alors de FLIM). En effet lors du transfert d’énergie, le temps de demie vie de fluorescence augmente pour les 2 fluorophores par rapport à la fluorescence des 2 molécules sans transfert d’énergie. Cette augmentation est proportionnelle à l’intensité du FRET entre les 2 molécules. Grâce à des appareils de mesure spécifique ont peu visualiser les interactions dynamiques entre 2 protéines dans une cellule.

5) Le FRET en biologie

En biologie la technique de FRET est principalement utilisé avec la GFP et ses dérivées. La GFP (Green fluorescent protein) est une protéine qui émet de la fluorescence verte. Elle a été découverte dans les méduses fluorescentes. Par génie génétique, le gène codant pour la GFP peut être fusionné à des gènes de protéines d’intérêt. Ces 2 gènes sont ensuite transfecté à des cellules qui exprimeront les protéines chimère fluorescente. Cela permet par microscopie à fluorescence de visualiser la localisation de la protéine chimère. Par mutation du gène GFP, de nombreuses autres gènes codant des protéines fluorescentesavec des couleurs de fluorescences et propriétés physico-chimiques ont pu être obtenus. Par exemple mHoneydew (jaune), mOrange (orange) mCherry (rouge).

Pour visualiser des interactions entre 2 protéines (héterodimerisation ou homodimerisation), on en fusionnera (par la méthode précédente) une avec une protéine fluorescente donneur et l’autre avec une autre accepteur (Figure 4). Si elles interagissent ensemble, la distance entre les 2 fluorophores sera faible et permettra le transfert d’énergie.

On peut aussi visualiser un changement de conformation d’une protéine grâce au FRET: en fusionnant sur 2 parties différentes d’une protéine, 2 fluorophores. Si la protéine est déplie ou lysé par protéolyse, les 2 fluorophores seront distants et il n’y aura pas de FRET. Si la protéine ce repli le couple de fluorophore sera proche et il y aura transfert d’énergie entre le donneur et l’accepteur.

Figure 4 : Exemple d’application du FRET en biologie. L’interaction de 2 protéines différentes peut être visualisé en fusionnant chacune avec un fluorophores. En fusionnant 2 fluorophores sur une protéine, on peut visualiser un changement de conformation ou une protéolyse.

Cependant ces techniques de FRET avec des protéines recombinantes ont quelques problèmes. Les fluorophores ont une taille importante (GFP 24 A de diamètre) et l’ajout sur les protéines se fait via des linkers (partie protéique reliant fluorophore à la protéine d’intérêt) augmente encore la taille. Cette augmentation de taille peut empêcher le transfert. L’expression des protéines chimères doit être assez forte dans les cellules.

Il est aussi possible de visualiser des interactions entre une protéine et son ligand non protéique. La protéines en se liant avec son ligand se repli et rapproche 2 fluorophores capable de faire du FRET. Grâce à cela, des chercheurs ont mis au point des « senseurs » de PIP2, d’AMPc, de phosphorylation et de calcium.

6) Caméléon senseur de Calcium

Les signaux calciques cellulaires sont très dynamiques. Ils varient très rapidement sur de grande distances. Les méthodesd’études des variations de Ca2+, via des chélateurs donne des résultats peu précis dans l’espace. Dans les années 90 l’équipe de Romoser VA[3] a créé une protéine chimère permettant de visualiser précisément dans l’espace et le tempsces variations (Figure 5).

Figure 5 : Protéine chimère Caméléon détectant le calcium par FRET[5]. La Calmoduline est fusionné via des linkers à un donneur BFP ou CFP et un accepteur GFP ou YFP. Quand CaM se lie à 4 Ca2+, elle se replie et rapproche donneur et accepteur. Il est possible alors de détecter du fret entre les 2.

Depuis la technique a été optimisé[4].

Le caméléon est une protéine chimère composé de 2 fluorophores dérivée de la GFP de méduse. Ils sont liés une calmoduline du muscle lisse, une protéine qui lie le calcium avec une forte affinité. Quand la protéine chimère lie le calcium, le fret est augmenté : la protéine chimère se replie et les 2 fluorophores se rapprochent et peuvent faire du FRET. A l’inverse quand la protéine n’est pas liée au calcium, les 2 fluorophores ne peuvent interagir ensemble, il n’y a pas de FRET. A l’origine on utilisait un donneur bleu (BFP) et un accepteur vert (GFP). Cependant la BFP est sensible au photobleaching (destruction du fluorophore) et a un faible rendement quantique. La technique a été améliorer par l’utilisation de fluorophore de couleur différente : Yellow Caméléon, Citrine Caméléon, Red Caméléon etc…. Ils ont des ph d’utilisations, des localisations cellulaires et des sensibilités au calcium qui varient. La gamme de détection de calcium va de 0,1 à 1000 μM

[6]Analyse cinétique de la concentration en calcium grâce aux Yellow Caméléon et ECFP-CaM et EYFP. Le muscle du tibia de souris transfectée avec une de ces 2 constructions a été soumis a des stimulations électrique à différentes fréquences. Ces stimulations provoquent une sortie de calcium du réticulum sarcoplasmique vers le cytoplasme.

En A, les images correspondant au ratio entre la fluorescence de l’accepteur sur celle du donneur. Obtenu en microscopie a fluorescence 2 photons. Quand il est élevé (rouge 1,4) il y a du FRET. Quand il est faible, il n’y a pas de FRET.

En B les graphes représente les valeurs moyenne de ratio le long de la fibre en fonction du temps. Plus les fréquences de stimulations augmentent, plus le ratio de FRET augmente. Il y a donc interaction entre la calmoduline et le calcium.

Avec une stimulation de 1 Hertz, il n’y a qu’un seul pic de calcium, donc une contraction. Avec une stimulation de fréquence de 5 Herzt, il y a 2 pics. Avec 50 Herzt le FRET est très intense, cela correspond une contraction tétanique.

7) Conclusion

Le transfert d’énergie entre molécules fluorescentes sous certaines conditions permet de visualiser leurs interactions. En biologie cette technique permet de visualiser des interactions entre protéines, des changements de conformation et d’autres signaux cellulaires. Cette technique permet de faire des études dynamiques. Cependant si une interaction entre 2 protéines n’est pas visualisée, on ne peut affirmer avec certitude qu’elles n’interagissent pas ensemble (faux négatifs). De plus cette technique nécessite une expression élevée des protéines, pas toujours physiologique. Il faut donc coupler cette technique avec d’autres approches comme, la coimmunoprecipitation, la fluorescence correlation spectroscopy, ou le BRET (bioluminescence résonance energy transfert)

8) Bibliographie et Source

Figure 1 :

http://commons.wikimedia.org/wiki/File:FRET-Jablonski-diagram.jpg

Figure 2 et 3 :

http://frontal.univ-angers.fr/unspf/2010_Strasbourg_Pigault_AbsorptionFluorescence/co/18_fret.html

Figure 4 :

http://research.nki.nl/jalinklab/Homepage%20Phys&ImgGrp%20GFP%20FRET%20Sensors.htm

1) Trugnan G, Fontanges P, Delautier D, Ait-Slimane T. (2004 Nov) [FRAP, FLIP, FRET, BRET, FLIM, PRIM…new techniques for a colourful life].Med Sci. ;20(11):1027-34.

2) RobertM.Clegg. THE HISTORY OF FRET: From conception through the labors of birth

http://server2.phys.uniroma1.it/doc/giansanti/BIOFISICA/BIOFISICA_2_2011_2012/materials-bf2-2012/2.Introduction%20to%20fluorescence/Clegg_history_RET.pdf

3)Persechini A, Lynch JA, Romoser VA.Novel fluorescent indicator proteins for monitoring free intracellular Ca2+. Cell Calcium. 1997 Sep;22(3):209-16.

4) Demaurex N, Frieden M.Measurements of the free luminal ER Ca2+ concentration with targeted “cameleon” fluorescent proteins. Nature. 1997 Aug 28;388(6645):882-7.

5) Miyawaki A, Llopis J, Heim R, McCaffery JM, Adams JA, Ikura M, Tsien RY. Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin. La Jolla 92093-0647,

6)Rudolf R, Mongillo M, Magalhães PJ, Pozzan T. In vivo monitoring of Ca(2+) uptake into mitochondria of mouse skeletal muscle during contraction. J Cell Biol. 2004 Aug 16;166(4):527-36.

Bodybulding sans fatigue

La Myostatine est une protéine secrétée par les cellules musculaires. Elle permet un contrôle de la taille des muscles (régulation) via la voie de signalisation des TGFbeta. La liaison de cette molécule à son récepteur présent sur les cellules musculaires déclenche une cascade de signalisation entraînant un blocage de la prolifération et différenciation des cellules satellites musculaires. Ces cellules satellites ont pour rôle de régénérer le muscle après l’effort ou des lésions. Pour résumer Myostatine diminue le nombre et la taille des fibres musculaires.

Certain enfants naissent avec une forme de myostatine mutée et inactive. Leurs muscles peuvent avoir une taille 2 fois plus importantes que ceux d’un enfant normal du même âge. Leurs forces est accru.germanLa races de boeuf bleu blanc belge a été créé par sélection d’animaux musclés. En analysant son génome, on a découvert une mutation sur le gène de la myostatine

belgianblue

Follistatine inhibe la myostatine. L’inhibition d’un inhibiteur de l’anabolisme musculaire induit son activation. Follistatine est impliquée dans le développement embryonnaire à diverse étapes. Récemment des chercheurs ont créer des souris sur-exprimant la follistatine voici leurs résultats

follistan-pictureA droite les souris sur-exprimant la protéine follistatin sont sur musclées. Ces recherches pourrait permettre la mise au point de traitements contre les myopathies. Certains bodybuildeurs l’utilise dans le but d’augmenter leurs masses musculaires :

http://www.professionalmuscle.com/forums/professional-muscle-forum/73021-follistatin-344-results-thread-17.html

Il faut noter qu’aucun test pré-clinique de cette molécule n’a été effectuée. Ces musclors pourrait a terme souffrir de problèmes cardiaques, de fertilités, d’espérance de vie diminué etc… (le corps humain est un moteur, le moteur surpuissant d’une Ferrari cassera plus rapidement qu’un petit moteur). Un esprit sain dans un corps sain, prenez soin de votre corps. Manger bouger et 5 fruits et légumes par jour.

vitruveLe Grand Humain

Les differents types de fibres musculaires

muscle

Les muscles sont composés de deux grands types de fibres. La proportion entre ces
deux types varie en fonction du muscle, de l’espèce étudiée, de l’entraînement, de l’âge et
des caractéristiques génétiques de l’individu.
Les fibres de type 1 ont une vitesse de contractions lentes. Les muscles possédant une majorité de ces fibres sont peu fatigables. Cette résistance à la fatigue est due à un métabolisme oxydatif aérobie : elles possèdent une grande densité de mitochondries, qui leurs permettent d’oxyder le glucose (via le cycle de krebs) pour former l’ATP, utilisé lors de la contraction.
Les fibres de types 2, à l’inverse des fibres de type 1, ont une contraction rapide. Leur
métabolisme est glycolitique, il y a peu  de mitochondries et donc moins de cycle de krebs. L’ATP est formé à partir de la glycolyse avec formation d’acide
lactique
Les différentes vitesses de contractions des 2 types de fibres, s’expliquent par la
présence d’isoformes de chaîne lourde de la myosine. Cette chaîne lourde a un rôle
dans l’activité ATPase de la myosine : en s’associant à l’actine, elle permet la contraction. Il existe plusieurs formes rapides et lentes de cette chaîne lourde de myosine (MHC), au total
10 isoformes ont été trouvées chez l’homme adulte. Dans les muscles rapides on retrouve 3 isoformes majeurs : MHC2B, MHC2X, MHC2A. Alors que dans les muscles lents, on retrouve MHC1 en majorité.

z5Sur cette coupe de muscle coloré à la NADH-TR. Les fibres lentes possédant l’enzyme sont colorées en foncées alors que les rapides sont en clair.

Rencontre dangereuse

Les tumeurs sont composées de cellules en croissance permanente.  Cela implique un apport riche en oxygène et en nutriment par les vaisseaux sanguins. Sur cette image d’immunohistochimie, les cellules cancéreuses en vert prolifèrent et migrent vers le tissu riche en vaisseaux en rouge. En plus de cela, elles induisent la production de nouveaux vaisseaux en secrétant des facteurs angiogéniques comme VEGF. En apportant de l’oxygène et des nutriments les vaisseaux vont participés à la croissance tumorale. Si les cellules cancéreuses se détachent de la tumeur via la transition epithélio mésenchymateuse ou mésenchymateuse améboide (encore plus efficace), elles peuvent envahir les vaisseaux sanguins et former des métastases.

574

Une rencontre dangereuse entre des cellules cancéreuses et des vaisseaux sanguins : Tuomas Tammela

Les yeux noirs

Galerie

Cette galerie contient 1 photo.

Photo d’un lobe optique en cour de développement. Les cellules vertes et bleu sont des neurones qui captent l’information visuel (intensité lumineuse, couleurs….) grâce à des photorécepteurs. Les cellules rouges sont les cellules du lobe optique. Photo de Aljoscha Nern, … Lire la suite

Composition moléculaire d’une cellule

Les cellules sont en grande partie composées d’eau, jusqu’à 90% de leurs poids. Toutes les réactions chimiques qui ont lieu dans celles ci sont en phase aqueuse.

En s’associant à l’hydrogène, l’oxygène et l’azote ( et d’autre atomes en plus faible quantités) les atomes de carbones forment les 4 grandes familles de molécules composant une cellule : protéines, lipide, sucre et acides nucléiques. Ce sont toutes des polymères formés par de monomères

Les monomères qui composent les protéines sont les acides aminés, il en existe une vingtaine aux propriétés chimiques et tailles différentes. Une protéine peut en posséder d’une dizaine jusqu’à 30000 (la titine est la protéine qui en possède le plus). Leurs rôles sont variés, elles peuvent structurer la forme de la cellule, participer au métabolisme (enzyme) et pleins d’autres fonctions……

Les sucres (ose ou monosaccharides en langage scientifique) sont composés de carbones associés à des groupements -OH (hydroxyle). Le nombre de carbone va de 3 à 7 : le ribose est un pentose (5 carbones) et le glucose un hexose (6 carbones) par exemple. Dans les cellules une quinzaine de ces oses s’associent entre eux et avec les protéines lipides et acides nucléiques, pour former des molécules complexes. Ils jouent un rôle dans le métabolisme en stockant l’énergie (par exemple sous la forme du glycogène dans les muscle)

Les lipides (ou acides gras) sont des molécules possédant une partie hydrophobe due a une longue chaîne de carbone (de 4 à 36 carbones). Ces molécules ont 2 rôles dans les cellules : le premier est de former les membranes plasmiques et le second est de stocker de l’énergie (notamment dans les cellules adipeuses). Les membranes biologiques sont composées principalement de phospholipides, un acide gras amphiphile (possédant une partie hydrophile)

Dans le monde vivant il y a deux types d’acides nucléiques : Adn et Arn. Les 2 types sont composés de 4 nucléotides différents s’enchaînant en formant un code. Le premier est situé dans le noyau des cellules et ne peut en sortir alors que le second est plus petit et sort du noyau. L’Adn contient l’information génétique codant pour l’ensemble des protéines de l’espèce. Pour décoder cette information l’Adn nucléaire est transcrit en Arn messager. Celui ci sort du noyau et est traduit en protéine.

La cellule contient un nombre et une variété vertigineuse de molécules. Elles interagissent entre elles lors de réactions chimique ce qui fait d’une cellule un système chimique extrêmement complexe.

414